Investigation of the relationship between sequence and structure in proteins: studies of inverse amino acid sequences

The 3D structure of a protein is directly connected with its function and for a long time it was believed that a folded structure is a prerequisite for a protein in order to be functional. The last decades though, significant methods have been developed and therefore the folding states of native proteins, folded/structured, unfolded/unstructured, molten globule and intrinsically disordered, have been determined and characterized. The four different protein folding states are determinant for the protein molecules function. The information about how a polypeptide chain will fold is encoded by its amino acid sequence. The genetic code is characterized by specific rules, according to which we get the polypeptide chain, whereas the code that connects the protein folding with its sequence is far more complicated. Considering the remarkable relation between protein structure and function, it is important to understand the rules that determine the protein folding pathway, as well as the protein folding states. Several research studies investigate the protein folding problem and the relationship between amino acid sequence and structure through limited extend or point mutations. In this study, the main goal is to approach this problem in an extreme way, through inverting the amino acid sequence. In this way we investigate how dissimilar two sequences can be and still adopt the same fold, as well as the folding states of these unnatural sequences. The tool for investigating the above topics is Rop protein. Rop forms one of the most common and simple structural motifs, the 4-α-helical bundle. Based on the wild type Rop and one of its mutants, RM6, the reverse sequences rRop and rRM6, have been designed and studied. Using biophysical and structural methods, such as size exclusion chromatography, circular dichroism, small angle X-ray scattering and X-ray crystallography, we studied the characteristics of the folding pathway of the reverse molecules and we compared their folding states with the forward ones. In addition, we observed the formation of hydrogel from the rRM6 molecule, which is a promising biomaterial for potential biological applications.Η τρισδιάστατη δομή μιας πρωτεΐνης είναι άμεσα συνδεδεμένη με τη λειτουργία της και για αρκετά χρόνια επικρατούσε η άποψη ότι μια πλήρως αναδιπλωμένη δομή είναι προαπαιτούμενο για να είναι μια πρωτεΐνη λειτουργική. Όμως τις τελευταίες δεκαετίες με την ανάπτυξη σημαντικών τεχνικών που έχουν αναπτυχθεί, έχουν προσδιοριστεί πιο ολοκληρωμένα οι καταστάσεις στις οποίες υπάρχουν οι πρωτεΐνες στη φύση, κι αυτές είναι 4: η folded/structured (διπλωμένη μορφή), η unfolded/unstructured (αποδιεταγμένη μορφή), η molten globule (κατάσταση εύπλαστης σφαίρας), και η intrinsically disordered κατάσταση. Και οι τέσσερις καταστάσεις είναι καθοριστικές για τη λειτουργία των πρωτεϊνικών μορίων. Η πληροφορία για το πώς μια πολυπεπτιδική αλυσίδα θα αναδιπλωθεί κωδικοποιείται από την αμινοξική της αλληλουχία. Ενώ ο γενετικός κώδικας καθορίζεται από συγκεκριμένους κανόνες, σύμφωνα με τους οποίους καταλήγουμε στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, ο κώδικας που καθορίζει την αναδίπλωση των πρωτεϊνών με βάση την αλληλουχία τους, χαρακτηρίζεται από τεράστια πολυπλοκότητα. Δεδομένης της αξιοσημείωτης σχέσης μεταξύ δομής και λειτουργίας μιας πρωτεΐνης, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τους παράγοντες που καθορίζουν το μονοπάτι αναδίπλωσης των πρωτεϊνικών μορίων, καθώς και τις καταστάσεις αναδίπλωσής τους. Το πρόβλημα της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών αποτελεί πεδίο έρευνας εδώ και πολλές δεκαετίες, με πολλές μελέτες να διερευνούν τη σχέση μεταξύ αμινοξικής αλληλουχίας και δομής μέσω σημειακών ή μικρής έκτασης μεταλλάξεων. Στην παρούσα εργασία ο βασικός στόχος είναι να προσεγγίσουμε το πρόβλημα αυτό ερευνώντας την πιο ακραία περίπτωση απόστασης μεταξύ δυο αλληλουχιών, όσον αφορά την ομοιότητά τους, αντιστρέφοντας την αμινοξική αλληλουχία. Με τον παραπάνω τρόπο διερευνούμε το πόσο ανόμοιες μπορεί να είναι δυο αλληλουχίες και να καταλήγουν σε παρόμοια δομή, καθώς και τις καταστάσεις αναδίπλωσης, των ξένων αυτών για τη φύση, αλληλουχιών. Προκειμένου να διερευνηθούν τα παραπάνω χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη Rop, της οποίας η δομή αποτελεί ένα από τα πιο συχνά δομικά μοτίβα, το 4-α-ελικοειδές δεμάτιο. Με βάση τη φυσική πρωτεΐνη Rop καθώς και ένα μετάλλαγμα αυτής, την πρωτεΐνη RM6, δημιουργήθηκαν και μελετήθηκαν οι αντίστροφες αλληλουχίες των δυο παραπάνω, οι rRop και η rRM6. Με τη χρήση βιοφυσικών τεχνικών και τεχνικών δομικής βιολογίας, όπως η χρωματογραφία μοριακής διήθησης, ο κυκλικός διχρωισμός, η περίθλαση ακτίνων Χ υπό μικρές γωνίες και η κρυσταλλογραφία, χαρακτηρίστηκε το μονοπάτι αναδίπλωσης της κάθε μιας και συγκρίθηκε με αυτό των πρωτότυπων αλληλουχιών. Τέλος, κατά την παραγωγή του δεύτερου μεταλλάγματος (rRM6) παρατηρήθηκε ο σχηματισμός υδρογέλης, υλικό πολύ σημαντικό λόγω των πολλαπλών βιολογικών εφαρμογών του

Probing Protein Folding with Sequence-Reversed α-Helical Bundles

Recurrent protein folding motifs include various types of helical bundles formed by α-helices that supercoil around each other. While specific patterns of amino acid residues (heptad repeats) characterize the highly versatile folding motif of four-α-helical bundles, the significance of the polypeptide chain directionality is not sufficiently understood, although it determines sequence patterns, helical dipoles, and other parameters for the folding and oligomerization processes of bundles. To investigate directionality aspects in sequence-structure relationships, we reversed the amino acid sequences of two well-characterized, highly regular four-α-helical bundle proteins and studied the folding, oligomerization, and structural properties of the retro-proteins, using Circular Dichroism Spectroscopy (CD), Size Exclusion Chromatography combined with Multi-Angle Laser Light Scattering (SEC-MALS), and Small Angle X-Ray Scattering (SAXS). The comparison of the parent proteins with their retro-counterparts reveals that while the α-helical character of the parents is affected to varying degrees by sequence reversal, the folding states, oligomerization propensities, structural stabilities, and shapes of the new molecules strongly depend on the characteristics of the heptad repeat patterns. The highest similarities between parent and retro-proteins are associated with the presence of uninterrupted heptad patterns in helical bundles sequences

Crystal structure of glutamate dehydrogenase 2, a positively selected novel human enzyme involved in brain biology and cancer pathophysiology

Mammalian glutamate dehydrogenase (hGDH1 in human cells) interconverts glutamate to α-ketoglutarate and ammonia while reducing NAD(P) to NAD(P)H. During primate evolution, humans and great apes have acquired hGDH2, an isoenzyme that underwent rapid evolutionary adaptation concomitantly with brain expansion, thereby acquiring unique catalytic and regulatory properties that permitted its function under conditions inhibitory to its ancestor hGDH1. Although the 3D-structures of GDHs, including hGDH1, have been determined, attempts to determine the hGDH2 structure were until recently unsuccessful. Comparison of the hGDH1/hGDH2 structures would enable a detailed understanding of their evolutionary differences. This work aimed at the determination of the hGDH2 crystal structure and the analysis of its functional implications. Recombinant hGDH2 was produced in the Spodoptera frugiperda ovarian cell line Sf21, using the Baculovirus expression system. Purification was achieved via a two-step chromatography procedure. hGDH2 was crystallized, X-ray diffraction data were collected using synchrotron radiation and the structure was determined by molecular replacement. The hGDH2 structure is reported at a resolution of 2.9 Å. The enzyme adopts a novel semi-closed conformation, which is an intermediate between known open and closed GDH1 conformations, differing from both. The structure enabled us to dissect previously reported biochemical findings and to structurally interpret the effects of evolutionary amino acid substitutions, including Arg470His, on ADP affinity. In conclusion, our data provide insights into the structural basis of hGDH2 properties, the functional evolution of hGDH isoenzymes, and open new prospects for drug design, especially for cancer therapeutics